Spektrofotometrična kolorimetrična kolorimetrična beljakovina
Beljakovine so običajno mešanica beljakovin. Kolorimetrične analize temeljijo na sestavinah beljakovin: aminokisline (npr. Tirozin, serin) reagirajo z dodatno kromogeno skupino ali barvilom, da proizvedejo barvni material. Koncentracija barvnega materiala je neposredno povezana s številom aminokislin, ki jih reagira protein, s čimer odražajo koncentracijo beljakovin.
Kolorimetrična metoda
Obstaja več metod, kot so BCA, Bradford in Lowry.
Metoda Lowry: Na podlagi prve biuretske reakcije in izboljšanja. Protein reagira s Cu2, da proizvede modro reakcijo. Vendar je metoda Lowry bolj občutljiva kot Biuret. Pomanjkljivost je, da je treba zaporedno dodati več različnih reagentov; reakcija traja dolgo; je dovzetna za snovi, ki niso beljakovine; beljakovine, ki vsebujejo EDTA, Triton x-100 in amoniak sulfat, niso primerne za to metodo.
Test bicinhoniinske kisline: to je novejši, bolj občutljiv proteinski test. Protein, ki ga je treba analizirati, reagira s Cu2 v alkalni raztopini, da proizvede Cu, ki tvori kelat s BCA, da nastane vijolična spojina s absorpcijskim vrhom pri 562 nm. Linearno razmerje med koncentracijo te spojine in proteinom je močno in spojina, ki nastane po reakciji, je zelo stabilna. Glede na metodo Lowry je operacija preprosta in občutljivost je visoka. Vendar pa je podobna metodam Lowry dovzetna za motenje beljakovin in detergentov.
Metoda Bradford: Načelo te metode je, da protein reagira s Coomassie Brilliant Blue, da proizvede obarvano spojino, ki absorbira pri 595 nm. Njegova največja značilnost je njegova občutljivost, kar je 2-krat več kot pri Lowry in BCA. Je preprostejša in hitrejša. Zahteva samo en reakcijski reagent. Spojina je lahko stabilna 1 uro, da olajša rezultat; Vmešavanje zdravila Lowry se BCA reagira z reducirnimi sredstvi (npr. DTT, merkaptoetanolom). Vendar je še vedno občutljiva na detergente. Glavna pomanjkljivost je, da različni standardi lahko privedejo do velikih razlik v rezultatih istega vzorca in brez primerljivih rezultatov.
Nekateri raziskovalci, ki so prvič izpostavljeni kolorimetričnim meritvam, lahko zmedejo rezultati različnih kolorimetričnih testov. Kakšne metode menite, da ste zmedeni? Ker so skupine reagirale na različne načine in kromogene skupine niso enake, se istočasno uporabljajo več metod, da bi bile koncentracije vzorca istega vzorca nedosledne. Na primer, Keller et al. testirali protein v materinem mleku in ugotovili, da so bile koncentracije, ki so jih merili Lowry in BCA, znatno višje kot pri Bradfordu. Razlika je bila pomembna. Tudi če je določen isti vzorec, je standardni vzorec, izbran z isto kolorimetrično metodo, neskladen, koncentracija po preskusu pa je tudi neskladna. Na primer, uporabite Lowry za testiranje beljakovin v celičnem homogenatu z uporabo BSA kot standarda s koncentracijo 1,34 mg / ml in globulinom kot standard s koncentracijo 2,64 mg / ml. Zato je pred izbiro kolorimetrične metode priporočljivo navesti kemično sestavo vzorca, ki ga je treba preskusiti, in poiskati kemično podoben standardni protein kot standard. Poleg tega kolorimetrična metoda za določanje količine beljakovin pogosto povzroča težave, saj je absorbančna vrednost vzorca prenizka, kar ima za posledico veliko razliko med izmerjeno koncentracijo vzorca in dejansko koncentracijo. Ključno vprašanje je, da barva pomembnega dela 1011 spektrofotometra, kivete, ima določeno razpolovno dobo, tako da vsaka kolorimetrična metoda navaja reakcijski testni čas. Vsi vzorci (vključno s standardnimi vzorci) morajo biti testirani v tem času. Če je čas predolg, dobljena vrednost absorbance postane manjša in pretvorjena vrednost koncentracije se zmanjša. Poleg tega sta reakcijska temperatura, pH vrednost raztopine itd. Pomembni dejavniki, ki vplivajo na eksperiment. Poleg tega je zelo pomembno uporabiti plastično kolorimetrijo. Izogibajte se uporabi kivet iz kremena ali stekla, ker bo barva po reakciji povzročila barvanje kremena ali stekla, kar bi povzročilo netočno absorbcijo vzorca.
Podjetje je specializirano za prodajo spektrofotometrov , dobrodošlih kupcev, ki potrebujejo svetovanje in nakup, vam bomo ponudili iskreno storitev in kakovostne izdelke ter nižje cene.
E-pošta: info@sumerlab.com
Splet: sumerinstrument.com