Uvod v načelo in uporaba splošnih komponent spektrofotometra

Spektrofotometer se široko uporablja v bioloških, kemijskih, kliničnih in okoljskih raziskavah.
Spektrofotometrija meri, koliko svetlobe lahko absorbira kemikalija, tako da se skozi vzorček v spektrofotometru preide snop svetlobe.
Z merjenjem zaznane jakosti svetlobe lahko metodo uporabimo za določitev koncentracije topljenca v vzorcu.
Koncept spektrofotometrije
Žarka, poslana vzorcu, je sestavljena iz fotonskega žarka.
Ko fotoni srečajo molekule v vzorcu, lahko molekule nekatere od njih absorbirajo, zmanjšajo število fotonov v snopu in zmanjšajo intenzivnost signala zaznavanja.
Prepustnost je del svetlobe, ki prehaja skozi vzorec. Opredeljena je kot jakost svetlobe, ki prehaja skozi vzorec pri intenzivnosti vpadne svetlobe.
Absorbanca je nasprotna prepustnosti, ki ustreza količini, izmerjeni s spektrofotometrom.
Glede na absorbance lahko koncentracijo vzorca raztopine določimo iz zakona Lambertovega zakona, iz katerega je razvidno, da obstaja absorpcija med koncentracijo in vzorcem. Po Lambertovem zakonu o pivu je absorbance produkt absorpcijskega koeficienta, ki je merilo količine svetlobe, ki jo absorbira topilo na določeni valovni dolžini, in razdalje, skozi katero preide svetloba. Vzorčenje ali potna razdalja in koncentracija topne snovi. Na splošno je cilj merjenja absorbance izmeriti koncentracijo vzorca.
Komponente spektrofotometra
Vsak spektrofotometer je sestavljen iz svetlobnega vira, kolimatorja (leča ali fokusirna naprava za oddajanje močnih in ravnih žarkov), monokromatorja za ločevanje žarkov različnih valovnih dolžin in izbirnika dolžine za izbiro vala ali žleba želene valovne dolžine. Valovna dolžina svetlobe, uporabljena na spektrofotometru, predstavljenem v tem videoposnetku, je v območju ultravijolične in vidne svetlobe. Spektrofotometer vključuje tudi držalo vzorca, fotodetektor in zaslon, ki prikazuje rezultate detektorja.
Najnovejši spektrofotometer je neposredno povezan z računalnikom, kjer je mogoče nadzirati eksperimentalne parametre in prikazati rezultate.
Načelo delovanja spektrofotometra
Pri izvajanju spektrofotometrije je pomembno upoštevati ustrezne varnostne ukrepe, na primer nošenje rokavic, odvisno od vrste biološke ali kemične raztopine, ki jo uporabljate.
Pred meritvijo UV-Vis spektra vklopite napravo in pustite, da se žarnica in elektronika segrejeta.
Pripravite slepi vzorec iste raztopine z istim pH in podobno ionsko jakostjo, vendar brez analiziranih komponent; ker lahko kiveta in topilo razpršita svetlobo, je treba analizirati vzorec.
Tradicionalno držalo za vzorec spektrofotometra je zasnovano za shranjevanje plastičnih in kremenčevih posod. Izvirno raztopino pipetirajte v posodo.
Ko obrišete kakršne koli prstne odtise in jih poškropite na zunanji strani posode, pravilno vstavite kiveto v držalo za vzorec in zaprite vrata pokrova.
Nikoli ne pozabite zapreti vrat, ker lahko UV žarčenje iz odprtega spektrofotometra poškoduje vaše oči in kožo.
Programirajte želeno valovno dolžino ali območje valovne dolžine, ki bo posredovano vzorcu. To je odvisno od najboljše valovne dolžine, ki jo lahko absorbira komponenta, ki se analizira. Nato se stroj izmeri z ničlo, tako da se izmeri prazen vzorec, ki odšteje spodnjo absorbanco zaradi blažilnika vzorcev.
Glede na vrsto spektrofotometričnega eksperimenta, ki ga izvajate, bo morda pred meritvijo vzorca treba izdelati standardno krivuljo, na podlagi katere je mogoče določiti koncentracijo spojine, analizirane v vzorcu.
Pustite, da vzorec doseže ustrezno temperaturo in rahlo premešajte, da ne pride do mehurčkov. Vzorec se nato lahko doda neposredno v posodo znotraj stroja in lahko se odčita.
Po tem, ko je bil vzorec izmerjen za absorbanco, se poskus pravilno izračuna; na primer za določitev koncentracije ali stopnje aktivnosti encimov.
Uporaba spektrofotometra
Ena izmed pogostih uporab spektrofotometra je merjenje celične gostote. Merjenje gostote celic lahko uporabimo za izdelavo logaritmične krivulje rasti bakterij, iz katere je mogoče določiti optimalni čas za integracijo rekombinantnega proteina.
Spektrofotometer se lahko uporablja tudi za merjenje hitrosti kemijske reakcije. V tej izvedbi se absorbance uporablja za spremljanje encimske reakcije, ki sčasoma izgine s pomočjo vmesne reakcije 452nm. Hitrost tega encimskega koraka je mogoče izračunati tako, da podatke primerjamo z ustrezno enačbo.
Uvedba mikro spektrofotometra odpravlja potrebo po imetniku vzorca. Ti spektrofotometri uporabljajo površinsko napetost za vzdrževanje vzorca.
Mikrospektrofotometer je najboljša izbira za merjenje mase in koncentracije majhnih in dragih vzorcev, kot so biomolekule, vključno z beljakovinami in nukleinskimi kislinami.
Absorbcija beljakovin pri 280 nm je odvisna od vsebnosti aromatičnih stranskih verig, ki jih najdemo triptofan, tirozin in fenilalanin, kot tudi disulfidne vezi med obema cisteinoma.
Koncentracijo beljakovin lahko določimo z njegovo absorbanco pri 280 nm in njenim absorpcijskim koeficientom, ki temelji na sestavi aminokislin.
DNK in RNA imata največjo absorbanco pri 260 nm, iz katere je mogoče določiti njihove koncentracije. Čistost nukleinskih kislin je mogoče oceniti tudi iz razmerja odčitkov absorbance v določenih valovnih dolžinah.