Spektrofotometri so postali rutinski instrumenti v sodobnih laboratorijih molekularne biologije. Pogosto se uporablja za nukleinsko kislino, kvantifikacijo beljakovin in kvantifikacijo koncentracij bakterijske rasti.
Enostavno načelo spektrofotometra
Spektrofotometer uporablja vir svetlobe, ki lahko generira več valovnih dolžin, in skozi niz spektroskopskih naprav ustvarja vir svetlobe določene valovne dolžine. Ko svetlobni vir preide skozi preskušani vzorec, se absorbira del svetlobnega vira in izračuna absorbanca vzorca, s čimer se pretvori v koncentracijo vzorca. . Absorbanca vzorca je sorazmerna koncentraciji vzorca.
Kvantifikacija nukleinskih kislin
Kvantifikacija nukleinskih kislin je najpogosteje uporabljena funkcija spektrofotometra. Oligonukleotide, enoverižne, dvoverižne DNA in RNA lahko količinsko opredelimo v pufru. Vrh absorpcije najvišjega absorpcijskega vrha nukleinske kisline je 260 nm. Molekularna sestava vsake nukleinske kisline je drugačna, zato so pretvorbeni faktorji različni. Za kvantificiranje različnih vrst nukleinskih kislin vnaprej izberite ustrezne koeficiente. Na primer, absorbanca 1 OD ustreza 50 μg / ml dsDNA, 37 μg / ml ssDNA, 40 μg / ml RNA in 30 μg / ml Oliga. Absorbance po preskusu pretvorimo z zgornjimi koeficienti, da dobimo ustrezno koncentracijo vzorca. Pred preskušanjem izberite pravilen postopek, vnesite prostornino osnovne raztopine in razredčila ter nato preskusite slepo in raztopino vzorca. Vendar pa poskus ni bil vedno gladek. Nestabilni odčitki so lahko največji glavobol za eksperimentatorja. Instrumenti z večjo občutljivostjo kažejo večji premik absorpcije.
Dejstvo je, da načelo zasnove in načelo delovanja spektrofotometra omogočata, da se absorbanca spreminja v določenem območju, kar pomeni, da ima instrument določeno natančnost in natančnost. Točnost Eppendorfovega biofotometra je na primer ≤ 1,0% (1A). Rezultati takšnih večkratnih testov se gibljejo med okoli 1,0% srednje vrednosti in so normalni. Poleg tega je treba upoštevati tudi fizikalno-kemijske lastnosti same nukleinske kisline in pH pufra, v katerem je nukleinska kislina raztopljena, koncentracije ionov itd .: Ko je koncentracija ionov med preskusom previsoka, odčitavanje, zato je priporočljivo uporabiti določeno vrednost pH in nizko koncentracijo ionov. Pufri, kot je TE, močno stabilizirajo odčitke. Koncentracija redčenja v vzorcu je tudi dejavnik, ki ga ni mogoče prezreti: zaradi neizogibne prisotnosti nekaterih drobnih delcev, zlasti vzorcev nukleinskih kislin, v vzorcu. Prisotnost teh majhnih delcev ovira rezultate testov. Da bi zmanjšali učinek delcev na rezultate preskusa, mora biti absorbanca nukleinske kisline vsaj večja od 0,1 A, absorbanca pa je prednostno med 0,1 in 1,5 A. V tem območju je interferenca delci so razmeroma majhni in rezultat je stabilen.
To pomeni, da koncentracija vzorca ne sme biti prenizka ali previsoka (zunaj preskusnega območja fotometra). Nazadnje, delovni faktorji, kot je mešanje, morajo biti zadostni, sicer je absorbančna vrednost prenizka, celo negativne vrednosti; mešanica ne more obstajati mehurčkov, prazna tekočina nima suspendiranih snovi, drugače se odčitava drastično; za testiranje slepega vzorca in vzorca je treba uporabiti isto kiveto. V nasprotnem primeru je razlika v koncentraciji prevelika; pretvorbeni faktor in enota koncentracije vzorca sta izbrana dosledno; kivete z obrabo oken ni mogoče uporabiti; prostornina vzorca mora doseči minimalno prostornino, ki jo zahteva kiveta.
Poleg koncentracije nukleinske kisline spektrofotometer kaže tudi nekaj zelo pomembnih razmerij, ki kažejo čistost vzorca, kot je razmerje A 260 / A 280, ki se uporablja za ocenjevanje čistosti vzorca, ker je absorpcijski vrh beljakovine. 280 nm. Čisti vzorec z razmerjem, večjim od 1,8 (DNA) ali 2,0 (RNA). Če je razmerje nižje od 1,8 ali 2,0, to pomeni prisotnost beljakovin ali fenolnih snovi. 230 kaže, da so nekateri kontaminanti prisotni v vzorcu, kot so ogljikovi hidrati, peptidi, fenoli itd., In razmerje čistejše nukleinske kisline A 260 / A 230 je večje od 2,0. A 320 zazna motnost raztopine in druge motnje. Za čiste vzorce je A 320 običajno 0.
Hangzhou Sumer Instrument Co., Ltd.
Dodaj: No.168 Wuchang Ave., okrožje Yuhang, Hangzhou 310023, Kitajska
TEL: + 86-571-88739859
Telefon: +8618658504900
E-naslov: info@sumerlab.com
Splet: sumerinstrument.com